透射式熒光顯微鏡:激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器,也可用普通集光器調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上。這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時熒光強(qiáng),而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光會減弱.所以對觀察較大的標(biāo)本材料較好。
落射式熒光顯微鏡:這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡,與上面不同的是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面,即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器,它與光鈾呈45度角,激發(fā)光被反射到物鏡中,并聚集在樣品上,樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進(jìn)入物鏡,反回到雙色束分離器,使激發(fā)光和熒光分開,殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊,可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。這種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻,成像清晰,放大倍數(shù)越大熒光越強(qiáng)。
透射熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn):
光源:高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/p>
聚光鏡:使用暗場聚光鏡,使激發(fā)光和熒光分離出來。
物鏡:可用任何種類的物鏡。
標(biāo)本:因?yàn)槭峭干溆^察,薄一些的標(biāo)本比較適合。
優(yōu)點(diǎn):
①由于用了暗場聚光鏡,激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡,因此容易形成暗的背景,得到良好的反差,且任何物鏡都可用于觀察。
②用低倍物鏡時,比反射熒光顯微鏡更亮。
缺點(diǎn):要正確調(diào)整聚光鏡中心和高度,否則不能獲得明亮的熒光像。由于暗視場聚光鏡焦距限制,不能使用厚的載玻片。視場照明區(qū)不能過大,否則容易使熒光標(biāo)本熒光色衰退。厚的或不透明的標(biāo)本不適用。
反射熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn):
光源:高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/p>
聚光鏡:因?yàn)槲镧R作為聚光鏡,所以不需要聚光鏡。
物鏡:所用物鏡要能透過足夠的紫外光,而且本身不產(chǎn)生熒光,對數(shù)值孔徑?jīng)]有限制。
標(biāo)本:厚的標(biāo)本或不透明的標(biāo)本都能觀察。
優(yōu)點(diǎn):
①由于物鏡兼作聚光鏡,不需要很多調(diào)節(jié)。
②采用柯勒式照明法,可利用孔徑光闌和視場光闌的效果。
③物鏡數(shù)值孔徑不受限制,在高放大倍率時,也可以獲得高分辨率的像。
④厚的或不透明的標(biāo)本也能觀察,厚的蓋玻片也能使用。
⑤其它觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用,特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合。
⑥可以避免不必要的熒光色衰退現(xiàn)象。
缺點(diǎn):在用低倍率物鏡時,像比較暗,因此要用大數(shù)值孔徑的物鏡。濾光鏡系統(tǒng)要有效地分離開激發(fā)光和熒光。