激光共聚焦顯微鏡能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品某一層的熒光信息進(jìn)行掃描。這一功能是通過其獨特的成像原理和結(jié)構(gòu)設(shè)計實現(xiàn)的。
成像原理
激光共聚焦顯微鏡利用激光作為光源,結(jié)合傳統(tǒng)熒光顯微鏡的成像技術(shù),并附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置。它通過計算機(jī)控制來進(jìn)行數(shù)字化圖像采集和處理。具體來說,激光光源發(fā)出的光被聚焦到樣品上形成一個很小的光點,該光點照射樣品后激發(fā)出的熒光被物鏡收集,并沿原照射光路回送到探測器。在光路和探測器前方都設(shè)有針孔,分別稱為照明針孔和探測針孔,兩者的幾何尺寸一致且共軛,使得只有來自焦平面的光能夠會聚在探測孔范圍之內(nèi),而來自焦平面上方或下方的散射光則被擋在探測孔之外,從而實現(xiàn)了對樣品某一層熒光信息的精確掃描。
結(jié)構(gòu)設(shè)計
激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號處理器、計算機(jī)以及圖像輸出設(shè)備等。其中,掃描模塊是核心部件,它由針孔光欄(控制光學(xué)切片的厚度)、分光鏡(按波長改變光線傳播方向)、發(fā)射熒光分色器(選擇一定波長范圍的光進(jìn)行檢測)和檢測器(如光電倍增管)組成。這些部件協(xié)同工作,實現(xiàn)了對樣品熒光信息的精確捕捉和處理。
工作流程
激光聚焦:激光光源發(fā)出的光通過一系列透鏡聚焦到樣品上,形成一個很小的光點。
熒光激發(fā):光點照射樣品后,樣品中的熒光物質(zhì)被激發(fā)并發(fā)出熒光。
熒光收集:發(fā)出的熒光被物鏡收集,并沿原照射光路回送到探測器。
針孔濾波:在光路和探測器前方的針孔對熒光進(jìn)行濾波,只有來自焦平面的光能夠進(jìn)入探測器。
信號轉(zhuǎn)換:探測器將接收到的熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號。
圖像處理:電信號經(jīng)過數(shù)字信號處理器處理后,傳輸?shù)接嬎銠C(jī)并生成圖像。
優(yōu)點與應(yīng)用
激光共聚焦顯微鏡具有分辨率高、視野廣、深度大、無損傷等優(yōu)點,能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的三維空間定位和高分辨熒光成像。它廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域,用于觀察活細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化,定量分析以及實時定量測定等。
綜上所述,激光共聚焦顯微鏡通過其獨特的成像原理和結(jié)構(gòu)設(shè)計,能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品某一層的熒光信息進(jìn)行精確掃描和成像。