激光共聚焦顯微鏡的技術原理主要基于激光掃描、共聚焦技術和數(shù)字圖象處理技術的結(jié)合。以下是對其技術原理的詳細介紹:
一、激光掃描技術
光源選擇:激光共聚焦顯微鏡采用激光作為光源,因為激光的單色性非常好,光源波束的波長相同,從根本上消除了色差。
點掃描成像:激光束經(jīng)過照明針孔后形成點光源,對標本內(nèi)焦平面上的每一點進行掃描。這種點掃描技術將樣品分解成二維或三維空間上的無數(shù)點,用十分細小的激光束(點光源)逐點逐行掃描成像。
二、共聚焦技術
共聚焦原理:在物鏡的焦平面上放置一個帶有小孔的擋板,將焦平面以外的雜散光擋住,消除了球差和進一步消除了色差。同時,照明針孔與檢測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的,焦平面的點同時聚焦于照明針孔和檢測針孔,焦平面以外的點不會在檢測針孔處成像。這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學橫斷面,克服了普通熒光顯微鏡圖像模糊的缺點。
光學切片:通過逐層掃描樣品的不同層面,并將其移到照明針孔和檢測針孔的共焦面上,可以得到各個層面的清晰圖像。這種技術被稱為“光學切片”,相當于對樣品進行了無損傷的連續(xù)切片觀察。
三、數(shù)字圖象處理技術
圖像獲取:檢測針孔后的光電倍增管逐點或逐線接收掃描信號,迅速在計算機監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。這些圖像是數(shù)字化的,可以在電腦中進行進一步的處理和分析。
圖像分析:利用計算機對獲取的圖像進行定量分析,如測量細胞的面積、平均熒光強度、積分熒光強度等參數(shù)。同時,還可以進行三維重建,從多個角度觀察標本的外形及剖面,得到三維的立體結(jié)構。
四、其他關鍵技術
靈敏度提升:光電倍增管的應用使得系統(tǒng)能夠檢測到非常微弱的熒光信號,大大提高了檢測的靈敏度。
動態(tài)監(jiān)測:激光共聚焦顯微鏡還可以進行實時動態(tài)監(jiān)測,如觀察活細胞內(nèi)離子濃度的動態(tài)變化等。
綜上所述,激光共聚焦顯微鏡通過激光掃描、共聚焦技術和數(shù)字圖象處理技術的綜合應用,實現(xiàn)了對樣品的高空間分辨率、高清晰度成像和定量分析。這些技術原理的結(jié)合使得激光共聚焦顯微鏡在生物學、醫(yī)學、材料科學等領域得到了廣泛應用,并成為這些領域中不可或缺的重要研究工具。