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微儀光學(xué)

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光學(xué)顯微鏡的主要觀察方法之熒光觀察的介紹

返回列表 來源:本站 發(fā)布日期:2023-02-10 10:37:06【

熒光現(xiàn)象

熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光照射下,幾乎同時(shí)發(fā)射出波長(zhǎng)更長(zhǎng)光的過程。當(dāng)特定波長(zhǎng)的光照射一個(gè)分子時(shí),光子能量被該分子的電子吸收。接著,電子從基態(tài)躍遷至較高的能級(jí),即激發(fā)態(tài)。這個(gè)過程稱為激發(fā)。電子在激發(fā)態(tài)停留10-9–10-8秒,在此過程中電子損失一些能量。電子離開激發(fā)態(tài)并回到基態(tài)的過程中,會(huì)釋放出激發(fā)過程中吸收的剩余能量。

熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時(shí)間為熒光壽命,一般為納秒級(jí)別,是熒光分子本身固有的特性。利用熒光壽命進(jìn)行成像的技術(shù)叫熒光壽命成像,可以在熒光強(qiáng)度成像之外,更加深入地進(jìn)行功能性精準(zhǔn)測(cè)量,獲取分子構(gòu)象、分子間相互作用、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學(xué)成像難以獲得的信息。

熒光的另一個(gè)重要特性是Stokes位移,即激發(fā)峰和發(fā)射峰之間的波長(zhǎng)差異。通常發(fā)射光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前,電子經(jīng)過弛豫過程會(huì)損耗一部分能量。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

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熒光顯微鏡及熒光濾塊

熒光顯微鏡是利用熒光特性進(jìn)行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡,廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn),非常適合進(jìn)行特定蛋白、細(xì)胞器等在組織及細(xì)胞中的分布的觀察,共定位和相互作用的研究,離子濃度變化等生命動(dòng)態(tài)過程的追蹤等等。

細(xì)胞中大部分分子不發(fā)熒光,想要觀察它們,進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的方法非常多,可以直接標(biāo)記,或利用抗體抗原結(jié)合特性進(jìn)行免疫染色,也可以用熒光蛋白標(biāo)記目標(biāo)蛋白,還可以用可逆結(jié)合的合成染料等。

目前熒光顯微鏡已成為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室及成像平臺(tái)的標(biāo)配成像設(shè)備,是我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)的好幫手。熒光顯微鏡主要分為三大類:正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、熒光體視鏡

熒光濾塊是顯微鏡熒光成像的核心部件,由激發(fā)濾片、發(fā)射濾片和二向分光鏡三部分組成,安裝在濾片轉(zhuǎn)輪里,不同的顯微鏡轉(zhuǎn)輪位數(shù)會(huì)有區(qū)別,也有些顯微鏡使用濾塊滑板。

濾塊在熒光成像中起著重要作用:激發(fā)濾片選擇激發(fā)光來激發(fā)樣品,阻擋其他波長(zhǎng)的光;通過激發(fā)濾片的光經(jīng)過二向分光鏡,反射后通過物鏡聚焦,照射到樣品,激發(fā)出對(duì)應(yīng)的熒光即發(fā)射光,發(fā)射光被物鏡收集,透過二向分光鏡,到達(dá)發(fā)射濾片。

熒光顯微鏡常用熒光濾塊可分為長(zhǎng)通和帶通兩種類型。帶通通常由中心波長(zhǎng)和區(qū)間寬度確定。

熒光物質(zhì)具有其特征性激發(fā)(吸收)曲線和發(fā)射曲線,激發(fā)峰為Z佳激發(fā)波長(zhǎng),發(fā)射曲線為發(fā)射熒光波長(zhǎng)范圍。因此,在實(shí)驗(yàn)中,我們會(huì)盡可能選擇與激發(fā)峰Z接近的波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā),而接收范圍需包括發(fā)射峰。

濾塊的詳細(xì)信息可以在顯微鏡成像軟件里看到。了解染料并找到Z匹配樣品的濾塊對(duì)于熒光成像有著至關(guān)重要的作用。熒光染料和熒光蛋白的光譜信息一般在說明書中會(huì)注明,也可在網(wǎng)上查閱

濾塊的選擇除考慮熒光探針的激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng),對(duì)于多色標(biāo)記樣品還需考慮是否有非特異激發(fā)、是否串色。此外還需考慮所使用的熒光光源,目前常用的熒光光源有汞燈、金屬鹵素?zé)簦约敖陙盹w速發(fā)展的LED光源。熒光光源的光譜有連續(xù)的和非連續(xù)的,在不同波段能量也會(huì)不同。LED光源因?yàn)槠湎鄬?duì)較窄的光譜帶、更穩(wěn)定的能量輸出、超長(zhǎng)的壽命、更安全環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn),正逐步成為熒光顯微鏡的主要光源。

除了顯微鏡內(nèi)置的濾塊,還有外置快速轉(zhuǎn)輪

熒光顯微成像技術(shù)應(yīng)用廣泛,種類豐富,而且新技術(shù)還在不斷涌現(xiàn),大家可以選擇Z適合的技術(shù)去完成自己的研究。