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微儀光學(xué)

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免疫熒光顯微成像詳解之免疫熒光常見問題分析

返回列表 來源:本站 發(fā)布日期:2023-02-14 09:50:55【

本期內(nèi)容我們一起走進免疫熒光常見問題的分析,幫助大家解決在實驗過程中遇到的一些問題,讓大家都能成為免疫熒光小能手。

常見問題

1、背景熒光高

① 洗滌不足:充分洗滌,適當增加洗滌次數(shù)和時間;

② 樣本干燥:在濕盒中孵育抗體,避免干燥;

③ 抗體濃度過高:預(yù)實驗測定Z佳濃度;

④ 樣本自發(fā)熒光:染色前先行檢測自發(fā)熒光情況;

⑤ 封閉不充分:延長封閉時間或更換封閉液;

⑥ 二抗非特異性結(jié)合:做一組只加二抗孵育的作為對照;

⑦ 抗體孵育時間過長:嚴格控制孵育時間,適當減少孵育時間;

⑧ 切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長(大于24小時):有時切片脫蠟至修復(fù)會過夜,第E天加抗體進行染色,如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4oC冰箱過夜,對結(jié)果無明顯影響,如果放在室溫,特別是炎熱的夏天,會出現(xiàn)背景著色,因此,不可存放時間太長;

⑨ 熒光背景噪音大:更換熒光顯微鏡,使用能夠降低背景熒光干擾的顯微鏡。

 熒光顯微鏡.png

2、熒光信號弱

① 熒光通道的激發(fā)波長和發(fā)射波長與染料不匹配:確保使用的顯微鏡的熒光通道與染料熒光基團的波長相匹配;

② 一抗或二抗不兼容:注意種屬是否正確;

③ 一抗不好用:陽性對照確認抗體有效性;

④ 固定過度或不充分:適當調(diào)整固定時間;

⑤ 樣本保存不當導(dǎo)致熒光淬滅:注意保存過程中的濕度和避光;

⑥ 一抗變質(zhì)或質(zhì)量差的多克隆抗體:注意抗體有效期,與新買抗體或用過的抗體作比較;

⑦ 信號弱或無信號:可裂解細胞后,用WB驗證目標蛋白在細胞中是否表達;

⑧ 顯微鏡收集熒光和成像的能力差:選擇一款相機配置好、熒光收集能力強、成像效果好的熒光顯微鏡

3、細胞/組織形態(tài)被破壞

① 組織從玻片上脫落或有氣泡:適當增加固定時間,封片時注意不要產(chǎn)生氣泡;

② 細胞或組織固定不充分,自發(fā)裂解:使用交聯(lián)性固定劑,適當增加固定時間;

③ 組織切片撕裂或有褶皺:切片過程導(dǎo)致的問題,考慮重新進行切片。

4、定位不對

可使用帶明場通道的熒光顯微鏡進行共定位

① 細胞核干擾:細胞核位置前面的細胞質(zhì)染色干擾造成,可以降低抗體濃度或孵育時間;

② 細胞或者組織狀態(tài)不對:細胞或者組織狀態(tài)不同導(dǎo)致目的蛋白細胞定位不同,造成Z后的定位不對,可重新培養(yǎng)細胞調(diào)整好狀態(tài)或者重新取材,進行再次染色;

③ 核定位不對:可將封閉和打孔合為一步,即在封閉液中添加0.5% TRITON-100,37℃封閉2h,加一抗后Z好4℃孵育過夜(16h);

④ 不確定觀察到的是不是需要的染色位置:使用帶明場通道的熒光顯微鏡,進行熒光定位,確定觀察到的染色位置是否正確。

對照實驗設(shè)置

①內(nèi)源性組織背景對照

某些含有固有的生物化學(xué)性質(zhì)的組織或細胞,會產(chǎn)生背景或自發(fā)熒光,對結(jié)果產(chǎn)生影響。以下圖為例,DAPI染核,F(xiàn)ITC染邊界和中間的晶狀結(jié)構(gòu),而TRITC染整個組織背景的顏色,但綠色也產(chǎn)生了背景熒光,對三通道疊加造成了干擾。

②陰性對照

使用確定不含有待測抗原的細胞或組織,與待測樣本統(tǒng)一處理,同一觀察,結(jié)果若為陰性,可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性。

③陽性對照

與陰性對照相反,用確定含有待測抗原的細胞或組織,與待測樣本統(tǒng)一處理,同一觀察,結(jié)果若為陽性,可證明待測抗原具有活性且實驗過程沒有問題,方法操作可靠。

免疫熒光高清成像

在精心完成免疫熒光后,選擇一款操作簡單、成像清晰、效果好的熒光顯微鏡進行觀察拍照,才能輕松得到更為理想的結(jié)果圖,達到事半功倍的效果。