超分辨顯微鏡工作原理的詳細介紹：對于傳統(tǒng)的光學顯微鏡，光的衍射讓成像分辨率限制在大約250 nm。如今，超分辨率技術(shù)可以將此提高10倍以上。這種技術(shù)主要通過三種方法實現(xiàn)：單分子定位顯微鏡，包括光敏定位顯微鏡（PALM）和隨機光學重建顯微鏡（STORM）；結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SIM）；以及受激發(fā)射損耗顯微鏡（STED）。

如何選擇超分辨率技術(shù)，這是大家都關(guān)心的。“不幸的是，并沒有簡單的原則來決定使用哪種方法，”英國牛津大學的博士后研究員Mathew Stracy說。“每一種都有其自身的優(yōu)點和缺點。”

科學家當然也在想辦法，為特定的項目選擇合適的方法。以色列理工學院的助理教授Yoav Shechtman表示：“在生物成像的背景下，要考慮的關(guān)鍵因素包括：空間和時間分辨率、對光損傷的敏感性、標記能力、樣本厚度，以及背景熒光或細胞自體熒光。”

工作原理

各種超分辨顯微鏡是以不同的方式工作的。以PALM和STORM為例，在特定時刻，只有一小部分熒光標記激發(fā)或光活化，使得它們能夠高精度地獨立定位。讓所有熒光標記都經(jīng)歷這個過程，這也就帶來了一幅完整的超分辨率圖像。2014年諾貝爾化學獎的獲得者之一、馬普生物物理化學研究所主任Stefan Hell表示：“PALM/STORM系統(tǒng)相對容易搭建，但比較難以應用，因為熒光基團要具有光活化能力。局限之處在于它們需要檢測細胞背景下的單個熒光分子，在可靠性上不及STED。”

STED使用激光脈沖來激發(fā)熒光基團，并使用環(huán)形的激光來淬滅熒光基團，只留下中間納米大小的熒光而得到超高分辨率。掃描整個樣本，可生成一幅圖像。“STED的優(yōu)勢在于它是一種按鈕技術(shù)，”Hell解釋說。“它用起來就像標準的共聚焦熒光顯微鏡。”它還可以利用一些熒光基團對活細胞進行成像，比如綠色或黃色的熒光蛋白和羅丹明衍生染料。