應(yīng)用功能

　　激光掃描共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)是近代*先進(jìn)的細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)分析儀器之一。它是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激光熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，不僅可觀察固定的細(xì)胞、組織切片，還可對(duì)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀察和檢測(cè)。目前，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)已用于細(xì)胞形態(tài)定位、立體結(jié)構(gòu)重組、動(dòng)態(tài)變化過程等研究，并提供定量熒光測(cè)定、定量圖像分析等實(shí)用研究手段，結(jié)合其他相關(guān)生物技術(shù)，在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域 得到廣泛應(yīng)用。

　　組織和細(xì)胞中的定量熒光測(cè)定

　　激光掃描共聚焦顯微鏡可以從固定和熒光染色的標(biāo)本以單波長(zhǎng)、雙波長(zhǎng)或多波 長(zhǎng)模式，對(duì)單標(biāo)記或多標(biāo)記的細(xì)胞及組織標(biāo)本的共聚焦熒光進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和定量分析,同時(shí)還可以利用沿縱軸上移動(dòng)標(biāo)本進(jìn)行多個(gè)光學(xué)切片的疊加， 形成組織或細(xì)胞中熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)的總體圖像,以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。 常用于原位分子雜交、腫瘤細(xì)胞凋亡觀察、單個(gè)活細(xì)胞水平的 DNA 損傷及修復(fù)等定量分析。

　　細(xì)胞間通訊的研究

　　動(dòng)物和植物細(xì)胞中縫隙連接介導(dǎo)的胞間通信在細(xì)胞增殖和分化中起著重要作用。 激光掃描共聚焦顯微鏡可通過觀察細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移來測(cè)量傳遞細(xì)胞調(diào)控信息的一些離子、小分子物質(zhì)。 該技術(shù)可以用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和作用，也可用于鑒別對(duì)縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。

　　細(xì)胞物理化學(xué)測(cè)定

　　激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)細(xì)胞形狀、周長(zhǎng)、面積、平均熒光強(qiáng)度及細(xì)胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)定。 能對(duì)細(xì)胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量、定性、定時(shí)及定位測(cè)定。

　　細(xì)胞內(nèi)鈣離子和 pH 值動(dòng)態(tài)分析

　　激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)是測(cè)量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對(duì)焦點(diǎn)信息的有效辨別使在亞細(xì)胞水平顯示離子分布成為可能。 利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可以測(cè)量單個(gè)細(xì)胞內(nèi) pH 和多種離子(Ca、K、Na、Mg)在活細(xì)胞內(nèi)的濃度及變化。 一般來說，電生理記錄裝置加攝像技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)離子量變化的速度相對(duì)較快,但其圖像本身的價(jià)值較低,而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鈣離子濃度動(dòng)態(tài)變化的圖像,這對(duì)于研究鈣等離子細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)有意義。

　　三維圖像的重建

　　傳統(tǒng)的顯微鏡只能形成二維圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡通過對(duì)同一樣品不同層面的實(shí)時(shí)掃描成像，進(jìn)行圖像疊加可構(gòu)成樣品的三維結(jié)構(gòu)圖像。 它的優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)樣品的立體結(jié)構(gòu)分析，能十分靈活、直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。

　　熒光漂白恢復(fù)技術(shù)

　　該方法的原理是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力，而鄰近未被漂白細(xì)胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴(kuò)散到已被漂白的細(xì)胞中，熒光可逐漸恢復(fù)。 可通過觀察已發(fā)生熒光漂白細(xì)胞其熒光恢復(fù)過程的變化量來分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸、受體在細(xì)胞膜上的流動(dòng)和大分子組裝等細(xì)胞生物學(xué)過程。

　　長(zhǎng)時(shí)程觀察細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)

　　活細(xì)胞觀察通常需要一定的加熱裝置及灌注室，以保持培養(yǎng)液的適宜溫度及 CO2 濃度的恒定。 目前的激光掃描共聚焦顯微鏡，其光子產(chǎn)生效率已大大改善，與更亮的物鏡和更小光毒性的染料結(jié)合后可以減小每次掃描時(shí)激光束對(duì)細(xì)胞的損傷,用于數(shù)小時(shí)的長(zhǎng)時(shí)程定時(shí)掃描,記錄細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。

　　應(yīng)用領(lǐng)域

　　在細(xì)胞及分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

　　激光掃描共聚焦顯微鏡應(yīng)用照明針與檢測(cè)孔共軛成像，有效抑制了焦外模糊成像并可對(duì)標(biāo)本各層分別成像，對(duì)活細(xì)胞行無損傷的"光學(xué)切片"這種功能也被形象的稱為"顯微 CT"。CLSM 還可以對(duì)貼壁的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群的胞內(nèi)、胞外熒光作定位、定性、定量及實(shí)時(shí)分析，并對(duì)胞內(nèi)成分如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、DNA、RNA、Ca2+、Mg2+、Na+ 等的分布、含量等進(jìn)行測(cè)定及動(dòng)態(tài)觀察，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能方面的研究達(dá)到分子水平。

　　在腫瘤和抗癌藥物篩選研究中的應(yīng)用

　　普通顯微鏡及電子顯微鏡，僅能對(duì)腫瘤相關(guān)抗原進(jìn)行定性分析，而 CLSM 則可對(duì)單標(biāo)記或者多標(biāo)記細(xì)胞、組織標(biāo)本及活細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)性極佳的熒光定量分析，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗原表達(dá)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，抗腫瘤藥物的作用及機(jī)制等方面定量化 。

　　在血液病學(xué)和醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究中的應(yīng)用

　　激光掃描共聚焦顯微鏡觀察免疫細(xì)胞和系統(tǒng)，如樹突狀細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)、自然殺傷細(xì)胞、淋巴細(xì)胞時(shí)，在準(zhǔn)確細(xì)胞定位的同時(shí)有效鑒定免疫細(xì)胞的性質(zhì)。

　　在大腦和神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用

　　激光掃描共聚焦顯微鏡分層掃描發(fā)現(xiàn)神經(jīng)軸突的內(nèi)部結(jié)構(gòu)連續(xù)性好。用激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察到腦干組織中神經(jīng)軸突的正常走向，可排除在熒光顯微鏡下由此造成的一些病理假象 。并且激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察神經(jīng)軸突的三維結(jié)構(gòu)，因此應(yīng)用 CLSM 有可能觀察到普通光鏡下未能發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)組織的細(xì)微病變[11]。

　　在眼科研究中的應(yīng)用

　　利用激光掃描共聚焦顯微鏡可以觀察晶狀體，角膜、視網(wǎng)膜、虹膜和睫狀體的結(jié)構(gòu)和病理變化[12]。

　　在骨科研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

　　激光掃描共聚焦顯微鏡在骨科研究領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀表明，CLSM在觀測(cè)骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究、骨細(xì)胞特異性蛋白(骨鈣素)以及骨細(xì)胞之間的相互作用具有顯著的優(yōu)勢(shì)。