1、 萊卡公司采用的超分辨技術(shù) STED
2000 年，德國科學(xué)家 StefanHell 開發(fā)了另一種超高分辨率顯微技術(shù)，其基本原理是通過物理過程來減少激發(fā)光的光斑大小，從而直接減少點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的半高寬來提高分辨率。當(dāng)特定的熒光分子被比激發(fā)波長長的激光照射時，可以被強(qiáng)行猝滅回到基準(zhǔn)態(tài)。利用這個特性，Hell 等開發(fā)出了受激發(fā)射損耗顯微技術(shù) (stimulated emission depletion，STED)。其基本的實(shí)現(xiàn)過程如圖 2 所示，就是用一束激發(fā)光使熒光物質(zhì)(既可以是化學(xué)合成的染料也可以是熒光蛋白)發(fā)光的同時，用另外的高能量脈沖激光器發(fā)射一束緊挨著的、環(huán)型的、波長較長的激光將第Y束光斑中大部分的熒光物質(zhì)通過受激發(fā)射損耗過程猝滅，從而減少熒光光點(diǎn)的衍射面積，顯著地提高了顯微鏡的分辨率，原理見下圖。

STED 成像技術(shù)的*大優(yōu)點(diǎn)是可以快速地觀察活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時變化的過程，因此在生命科學(xué)中應(yīng)用更加廣泛。

2、 蔡司公司采用的超分辨技術(shù) PLAM
2002 年，Patterson 和 Lippincott‐Schwartz 首次利用一種綠色熒光蛋白(GFP)的變種(PA‐GFP)來觀察特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動軌跡。這種熒光蛋白 PA‐GFP 在未激活之前不發(fā)光，用 405nm 的激光激活一段時間后才可以觀察到 488nm 激光激發(fā)出來的綠色熒光。德國科學(xué)家EricBetzig 敏銳地認(rèn)識到，應(yīng)用單分子熒光成像的定位精度，結(jié)合這種熒光蛋白的發(fā)光特性，可以來突破光學(xué)分辨率的J限。2006 年 9月，Betzig 和 Lippincott‐Schwartz 等首次在 Science 上提出了光激活定位顯微技術(shù)(photoactivated localization microscopy，PALM)的概念。其基本原理是用 PA‐GFP 來標(biāo)記蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié) 405nm 激光器的能量，低能量照射細(xì)胞表面，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個熒光分子，然后用 488nm 激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子。在確定這些分子的位置后，再長時間使用 488nm 激光照射來漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來。之后，分別用 405nm 和 488nm 激光來激活和漂白其他的熒光分子，進(jìn)入下一次循環(huán)。這個循環(huán)持續(xù)上百次后，我們將得到細(xì)胞內(nèi)所有熒光分子的精確定位。將這些分子的圖像合成到一張圖上，*后得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高 10 倍以上分辨率的顯微技術(shù)，原理如下：

PLAM 通過定位細(xì)微結(jié)構(gòu)乃至單分子，實(shí)現(xiàn) 20 nm 的橫向分辨率和 50 nm 軸向分辨率。

3、 尼康公司采用的超分辨技術(shù) STROM 和 SIM STROM
2006 年底，美國霍華德‐休斯研究所的華裔科學(xué)家莊曉薇實(shí)驗(yàn)組開發(fā)出來一種類似于 PALM 的方法，可以用來研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白的超分辨率定位。他們發(fā)現(xiàn)，不同的波長可以控制化學(xué)熒光分子 Cy5 在熒光激發(fā)態(tài)和暗態(tài)之間切換，例如紅色 561nm 的激光可以激活 Cy5 發(fā)射熒光，同時長時間照射可以將 Cy5 分子轉(zhuǎn)換成暗態(tài)不發(fā)光。之后，用綠色的 488nm 激光照射 Cy5 分子時，可以將其從暗態(tài)轉(zhuǎn)換成熒光態(tài)，而此過程的長短依賴于第E個熒光分子 Cy3 與 Cy5 之間的距離。因此，當(dāng) Cy3 和 Cy5 交聯(lián)成分子對時，具備了特定的激發(fā)光轉(zhuǎn)換熒光分子發(fā)射波長的特性。將 Cy3 和 Cy5 分子對膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來標(biāo)記細(xì)胞的內(nèi)源蛋白。應(yīng)用特定波長的激光來激活探針，然后應(yīng)用另一個波長激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子，此過程循環(huán)上百次后就可以得到*后的內(nèi)源蛋白的高分辨率影像，被他們命名為隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù) (stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)。2007 年，他們進(jìn)一步改進(jìn) STORM 技術(shù)，發(fā)展了不同顏色的變色熒光分子對，可以同時記錄兩種甚至多種蛋白質(zhì)的空間相對定位，從而闡明籠形蛋白 clathrin 形成的內(nèi)吞小泡與細(xì)胞骨架蛋白之間的精確空間位置關(guān)系，兩種顏色的分辨率都可以達(dá)到 20～30nm。原理如下圖：

STORM 通過一對染料對通過隨機(jī)發(fā)光空間定位，實(shí)現(xiàn)了 XY 20 nm 分辨率。

SIM
改變光學(xué)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)來突破光學(xué)J限的另一個方法是利用飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(saturated structure illumination microscopy，SSIM)。早在 1963 年，Lukosz 和 Marchand 就提出了特定模式側(cè)向入射的光線可以用來增強(qiáng)顯微鏡分辨率的理論。2005 年，加州大學(xué)舊金山分校的 Gustafsson 博士首先將非線性結(jié)構(gòu)性光學(xué)照明部件引入到傳統(tǒng)的顯微鏡上，得到了分辨率達(dá)到 50nm 的圖像。SSIM 技術(shù)的原理是將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息。如圖所示：

SIM 通過結(jié)構(gòu)照明莫爾紋原理實(shí)現(xiàn)了任何熒光染料都可以達(dá)到 XY 100nm。 

4、 奧林巴斯公司采用的 OSR 技術(shù)
圖像超分辨率重構(gòu)(super resolution。SR)是指利用計算機(jī)將一幅低分辨率圖像（low resolution，LR）或圖像序列進(jìn)行處理，恢復(fù)出高分辨率圖像（high resolution，HR）的一種圖像處理技術(shù)。奧林巴斯超分辨技術(shù)通過高倍 60X 或者 100X 油鏡，通過縮小共聚焦上的針孔，用強(qiáng)激光將樣品掃描 20~50 次后通過軟件進(jìn)行運(yùn)算重構(gòu)，此技術(shù)存在一定的局限性：
①要使用高倍油鏡低倍不適用
②因縮小針孔需使用強(qiáng)激光對樣品損傷比較大。
③對樣品掃描 20~50 次，樣品熒光淬滅嚴(yán)重，更不適用于活細(xì)胞。
④環(huán)境要求較高，在做 20~50 次的過程中因環(huán)境振動等引起*后軟件運(yùn)算不準(zhǔn)確。
⑤共聚焦圖片均為軟件著色，不能做多色熒光標(biāo)記，容易引起串色。